TP4 : Extraction et Dosage des pigments photosynthétiques

• Matériels et réactifs

Un mortier et pilon ; sable de mer ; carbonate de calcium une éprouvette (25, 50, 100mL) ; un papier filtre ; feuilles des végétaux ; un bécher (10 et 50 mL) ; erlenmeyer (10 et 50 mL) ; un entonnoir, une pipette Pasteur ; fiole 20ml ; Acétone à 80 %.

2. Extraction des différents pigments photosynthétiques

• Pesez 1 g des feuilles fraîches.
• Placer les feuilles coupées dans un mortier
• Ajouter 4 ml d’acétone à 80 %
• broyés dans 4ml d’acétone à 80 % en présence de sable (pour faire éclater les cellules) et de carbonate de calcium afin de neutraliser le milieu d'extraction.
• Ajouter 6mL d’acétone à 80% et broyer de nouveau soigneusement.
• Laisser décanter quelques minutes
• Filtrer le broyat sur papier filtre dans un erlenmeyer 10 mL et compléter à 10mL avec de l’acétone à 80%
• Fermer avec du parafilm et agiter.
• Les lectures de D.O seront réalisées à des longueurs d’onde 647 et 663 nm pour les chlorophylles et 470 nm pour les caroténoïdes

3. Dosage proprement dit :

Le dosage sera réalisé par méthode colorimétrique ; les pigments étant naturellement colorés. Pour cela, il faut lire les densités optiques (D.O) des échantillons à l’aide de spectrophotomètre préalablement étalonné avec de l’acétone 80 % (correspondant à D.O = 0).

- Introduction 2mL d’extrait pigmentaire dans une fiole jaugée de 20 mL et compléter avec de l’acétone à 80% ;

- Fermer la fiole avec du Parafilm et agiter

- Placer une cuve en verre, qui contient le solvant d’extraction, dans le faisceau et régler le zéro de l’appareil à 460nm. - remplacer cette cuve par une autre qui est emplie au 2/3 par l’extrait pigmentaire dilué et lire l’absorbance (A) ;

- Recommencer les opérations successivement à 645 et 663nm (régler le zéro de l’appareil pour chaque longueur d’onde utilisée).

Chl a (μg / ml) = 12.7 x D.O₆₆₃ – 2.7 x D.O₆₄₇

Chl b (μg / ml) = 22.9 x D.O₆₄₇ – 4.7 x D.O₆₆₃

Chl a + Chl b = Chl totale (μg / ml) = 20.2 x D.O₆₄₇ + 8.02 x D.O₆₆₃

Caroténoïdes (μg / ml) = {(1000* D.O₄₇₀)-[(1.82*chla) + (85.02*Chl b)]}/198

Questions de compte- rendu (10 points)-

- Préciser le but de ce TP (O1,5 point)

- principe de Tp (1,5point)

- Calculer les teneurs en µg / ml pour les différents pigments : Chl a , Chl b , Chl a + Chl b et Caroténoïdes . (O6 points )

- Exprimer les teneurs en mg /l.(  0,5point)

- Exprimer les teneurs en mg/ Kg PF des Feuilles   (0,5 point)