TP5 : Extraction et séparation des différents pigments photosynthétiques

Ce TP, portant sur la nutrition carbonée chez les plantes. Il permet aux étudiants de connaitre comment réaliser une extraction d’une chlorophylle brute et identifier sa composition en pigments.

Rappelle

La CCM est une technique qui repose sur la différence d’affinité des substances à analyser

vis à vis d’une phase stationnaire et d’une phase mobile.

• La phase stationnaire est constituée d’alumine ou de silice étalée en couche mince sur une plaque d’aluminium. Ces solides ont des propriétés adsorbantes : ils forment des interactions de Van der Waals et parfois des liaisons hydrogène avec les molécules éluées.
• La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants appelée éluant. Lorsque l’échantillon a été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent par capillarité à une vitesse qui dépend des interactions qu’elles créent avec la phase mobile et la phase stationnaire. Chaque constituant migre d’une certaine hauteur, caractéristique de la substance, que l’on appelle rapport frontal ou rétention frontale (Rf).

Rf = h/H

Buts de TP

- Extraction de la chlorophylle brute d’une feuille d’épinard.

- Connaître et comprendre le principe de la C.C.M.

- Réaliser une CCM (Séparation des pigments constitutifs).

- Déterminer la composition en pigments des feuilles d’épinards par CCM.

1. Matériel et produits utilisés

- Plaques CCM, Cuves CCM, Capillaires pour faire les dépôts, mortier + pilon, Entonnoirs, des ciseaux, Eprouvette de 100ml, papier filtre, Béchers, Sèche-cheveux ;

Crayon et Règle, chambre noire ;

- Système solvant (V /V) : Ether de pétrole/Ether diéthylique (40/60) : 100 ml, Les feuilles d’épinard, 1 pincée de sable mince, chloroforme et dichlorométhane ;

 

2. Mode opératoire

• Préparation de l'éluant et de la cuve chromatographique
• On utilise un système solvant contenant (V /V) : 40 ml d’éther de pétrole, 60 ml d’éther

diéthylique, pour 100 ml de la phase mobile.

-Verser l'éluant dans la cuve CCM sur une hauteur de 2cm.

-Recouvrir la cuve pour que l’air qu’elle contient soit saturé des vapeurs de l’éluant.

• Préparation de la plaque CCM

-On trace la ligne de départ et les points de dépôts à environ 1.5cm du bord inférieur de la plaque.

• Extraction de la chlorophylle brute

- Couper finement les feuilles des épinards (saines et propres), dans un mortier contenant une

pincée de sable pour écraser les cellules et quelques ml de chloroforme et de dichlorométhane,

jusqu’à obtention d’un liquide vert dense.

- Broyer à l'aide du pilon jusqu'à l’obtention d'un liquide vert dense.

- Filtrer le liquide obtenu, on récupère une solution alcoolique de chlorophylle brute.

- Évaporer le solvant à l’évaporateur rotatif, on obtient une pâte verte foncée.

- Dissoudre la pâte verte obtenue dans quelques ml de chloroforme.

• Chromatographie de la solution de chlorophylle brute

- A l'aide des tubes capillaires, déposer une très petite goutte de solution alcoolique de pigments

sur la plaque CCM. La tache finale ne doit pas excéder un diamètre de 5 mm.

- Sécher puis recommencer l’opération pour les concentrer, (bien superposer les tâches) : faire

ainsi 8 dépôts successifs en séchant entre chaque dépôt à l’aide d’un sèche-cheveux.

- On Place la plaque de silice dans la cuve en position verticale, on ferme et on laisse migrer

l'éluant (20 min de temps de migration).

- N.B : On ne déplacera pas la cuve pendant la migration de l’éluant.

-Retirer la plaque quand l’éluant est à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque.. Mode opératoire

3. Résultats : Exploitation du chromatogramme (Noté /10 points)

• Dessiner le chromatogramme, identifier les pigments en vous aidant des formules,

Justifier leurs ordres de migration.

a) β-Carotène(C40H56) : de couleur orangé ; Rf= 0.89-0.98

b) Chlorophylle a (C55H72O5N4Mg) : de couleur vert bleuté ; Rf= 0.24-0.30

c) Chlorophylle b (C55H70O6N4Mg) : de couleur vert jaune ; Rf= 0.20-0.26

d) Xanthophylle (C40H56O2) : de couleur jaune. ; Rf= 0.04-0.28

e) Phéophytine a Rf= 0.42-0.49 Gris

f) Phéophytine b Rf= 0.33-0.40 Marron

• Calculer le rapport frontal Rf de chaque pigment dans l’extrait étudié, sachant que :

Rf = h / H ( h : hauteur atteinte par l’espèce étudiée, H : hauteur atteinte par l’éluant )

NB : Le rapport frontal Rf est le quotient de la distance parcourue par le composé déposé au départ sur la ligne de dépôt par la distance parcourue par l'éluant (H) soit :

Rf = h / H avec toujours : Rf < 1 Le rapport frontal dépend du composé, de l'éluant. Mais il reste le même que le composé soit pur, dilué ou qu'il soit dans un mélange.